牛膝是莧科植物牛膝 Achyranthes bidentata Bl. 的 干燥根，產(chǎn)于我國南溫帶亞濕潤氣候區(qū)，黃河以 北、海拔 200 m 以下的沖積平原最適宜栽培，其傳 統(tǒng)產(chǎn)區(qū)為河南焦作（古懷慶府），當(dāng)?shù)匾延?2000 多年 的栽培歷史，所產(chǎn)牛膝條子粗壯、明亮、色澤鮮 艷、油性大，加上廣大藥農(nóng)在長期的生產(chǎn)實(shí)踐中積 累了豐富的栽培經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)造了獨(dú)特的加工技術(shù)，成 就了道地藥材懷牛膝?，F(xiàn)在懷牛膝產(chǎn)區(qū)逐步外延， 在國內(nèi)形成三大牛膝產(chǎn)區(qū)：內(nèi)蒙赤峰牛營子鎮(zhèn)，河 北安國市周邊，河南武陟大虹橋、大封鎮(zhèn)和溫縣趙 堡鎮(zhèn)。牛膝主要化學(xué)成分包括三萜皂苷類、甾酮 類、多糖類、黃酮類等，藥理作用包括抗骨質(zhì)疏 松、改善血液循環(huán)、抗動脈粥樣硬化、促進(jìn)神經(jīng)生 長、改善糖代謝等 。

1260 型高效液相色譜儀（美國安捷倫科技 有限公司）；MS204S 萬分之一分析天平、XP205 十 萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；電子天平（賽多利斯）；KQ250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公 司）；LGJ-12 低溫冷凍干燥儀（北京松源華興科技發(fā) 展有限公司）；SB-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、A-1000S真空泵（日本東京理化器械株式會社）。

β-蛻皮甾酮對照品 （批號：111638-201706，純度：98.4%）、牛膝對照 藥材（批號：121066-201508）、人參皂苷 Ro 對照品 （批號：111903-201604），中國食品藥品檢定研究 院。試劑乙腈、甲醇為色譜純；水為屈臣氏蒸餾 水；其他試劑均為分析純。

16 批牛膝飲片（S1~S16）來源：河北安國 （S1~S3）、河南武陟（S4~S10）、河南孟州（S11~S13）、 內(nèi)蒙赤峰（S14~S16），經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)王洛臨主任 中藥師鑒定，均為莧科植物牛膝 Achyranthes bidentata Bl. 的干燥根。由本實(shí)驗(yàn)室根據(jù)《中藥配方顆粒質(zhì)量控 制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見稿）制備牛膝的標(biāo) 準(zhǔn)湯劑。另取內(nèi)蒙赤峰飲片（S14~S16）分別制備 3 批 配方顆粒樣品。

標(biāo)準(zhǔn)湯 劑：根據(jù) 《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù) 要求》 和國家中醫(yī)藥管理局 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室 管理規(guī)范》，稱取牛膝，煎煮 2 次。第 1 次加水 9 倍 量，浸泡 30 min，煎煮 30 min，濾過；第 2 次加水 7 倍量，煎煮 20 min，濾過，濾液合并，減壓濃縮至 飲片投料量，即浸膏濃度為 1 g·mL-1 ，冷凍干燥，即 得標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉。 配方顆粒：取牛膝 2 500 g，煎煮 2 次。第 1 次 加水 8 倍量，煎煮 30 min；第 2 次加水 6 倍量，煎 煮 30 min；濾過，濾液合并，減壓濃縮至相對密度 為 1.05～1.10（60 ℃）的浸膏，噴霧干燥，得干膏 粉；加入麥芽糊精適量，混勻，制成顆粒 1 000 g， 即得。 2.2 TLC 法鑒別牛膝針標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒中的指 標(biāo)成分

取牛膝標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉和 配方顆粒各約 1 g，加 80%甲醇 50 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?15 mL，微熱使 溶解；加在 D101 大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為 1.5 cm， 柱高為 15 cm）上，用水 100 mL 洗脫，棄去水液；再 用 20%乙醇 100 mL 洗脫，棄去洗脫液；繼用 80%乙 醇 100 mL 洗脫；收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?80%甲 醇 1 mL 使溶解，即得。

取 β-蛻皮甾酮對照品和人 參皂苷 Ro 對照品適量，加甲醇制成每 1 mL 分別含 β-蛻皮甾酮 1 mg、人參皂苷 1 mg 的混合對照品溶液。

取牛膝對照藥材 2 g， 加 80%甲醇 50 mL，加熱回流 3 h。按 2.2.1 項(xiàng)下方法制備對照藥材溶液。

按照《中國藥典》2015 年版四部通則 （0502），吸取供試品溶液、對照藥材溶液和對照品 溶液各 4 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上；以三 氯甲烷-甲醇-水-甲酸（7∶3∶0.5∶0.05）為展開劑，展 開，取出晾干，噴以 5%香草醛硫酸溶液，在 105 ℃ 加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果見圖 1、2。以牛膝對照 藥材溶液、β-蛻皮甾酮和人參皂苷 Ro 為參照，牛膝 標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒樣品溶液在同一硅膠 G 薄層板 相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.3 指標(biāo)成分含量測定

2.3.1 供試品溶液的制備

取 S1~S16 批牛膝飲片粉 末（過 3 號篩）各約 1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶 中，加水飽和正丁醇 30 mL，密塞，浸泡過夜；超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz）30 min，濾過；用 甲醇 10 mL 分?jǐn)?shù)次洗滌容器及殘?jiān)?，合并濾液和洗 液，蒸干；殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至 5 mL 量瓶， 加甲醇至刻度，搖勻，即得。 另取牛膝標(biāo)準(zhǔn)湯劑和配方顆粒樣品各約 0.5 g， 精密稱定，置具塞錐形瓶中。精密加入甲醇 25 mL， 稱定質(zhì)量，超聲處理（功率 250 W，頻率 40 kHz） 30 min，放冷，稱定質(zhì)量；用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

取 β-蛻皮甾酮對照品適 量，精密稱定，加甲醇使溶解制成每 1 mL 含 24.3 μg 的溶液，即得。

采用 Agilent ZORBAX Eclipse C18 柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）。 以乙腈-0.1%甲酸水溶液（16∶84）為流動相；檢測波 長為 250 nm。理論板數(shù)按 β-蛻皮甾酮峰計(jì)算應(yīng)不低 于 4 000。此色譜條件下，供試品溶液中待測指標(biāo)成 分 β-蛻皮甾酮分離度良好。

精密吸取 β-蛻皮甾酮對照品 溶液 1、2、4、6、8、10 μL，按 2.3.3 項(xiàng)下色譜條件 分別進(jìn)樣測定，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱 坐標(biāo)（Y），得回歸方程 Y=1 647 876.54X－1 557.91，r＝ 1.000 0，β-蛻皮甾酮線性范圍為 0.024 3～0.243 0 μg。

取 β-蛻皮甾酮對照品溶液，按 2.3.3 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次，結(jié)果 β-蛻皮甾酮 峰面積 RSD 為 0.65%，表明精密度良好。

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S1）供試品溶液，分 別放置 0、2、4、6、8、12 h 時(shí)，按 2.3.3 項(xiàng)下色譜 條 件 測 定 ， 結(jié) 果 β- 蛻 皮 甾 酮 峰 面 積 的 RSD 為 1.29%，說明供試品溶液在 12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

取標(biāo)準(zhǔn)湯劑（S1）供試品溶液， 按照 2.3.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.3.3 項(xiàng)下 色譜條件測定，平行 6 次。結(jié)果 β-蛻皮甾酮質(zhì)量分 數(shù)平均值為 0.096%，RSD 為 1.22%，表明該方法重 復(fù)性良好。

精密稱取牛膝標(biāo)準(zhǔn)湯劑 （S1）樣品粉末 0.25 g（β-蛻皮甾酮含量為 0.096%）， 平行 6 份；各加入 β-蛻皮甾酮對照品 0.243 0 mg， 混勻，按 2.3.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.3.3 項(xiàng)下色譜條件測定。結(jié)果平均加樣回收率為 92.34%， RSD 為 1.21%，表明加樣回收率良好。 2.3.5 指標(biāo)成分含量測定 分別取 S1～S16 批牛膝飲 片及其標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉、S14~S16 批配方顆粒，按 2.3.1 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按 2.3.3 項(xiàng)下色譜條 件測定，結(jié)果見表 1。S1～S16 批飲片 β-蛻皮甾酮含 量為 0.066%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率和 β-蛻皮甾酮含量分 別為 32.906%、0.102%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率為 51.82%。 按照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》 （征求意見稿），取平均值的 70%～130%分別作為 4 者的變異可接受范圍，則各指標(biāo)范圍飲片 β-蛻皮甾 酮含量為 0.46%～0.85%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率 23.03%～ 42.78%，標(biāo)準(zhǔn)湯劑 β-蛻皮甾酮含量 0.071%～ 0.133%， 標(biāo)準(zhǔn)湯劑轉(zhuǎn)移率 36.28%～67.37%。經(jīng)測定，3 批配方 顆粒（S14~S16）出膏率、β-蛻皮甾酮含量、β-蛻皮甾 酮轉(zhuǎn)移率平均值為 35.45%、0.121%、59.13%，均在 標(biāo)準(zhǔn)湯劑規(guī)定值范圍內(nèi)，說明該配方顆粒制備工藝 基本合理。

中藥配方顆粒應(yīng)遵從傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論，在融合現(xiàn) 代工藝設(shè)備基礎(chǔ)上盡可能地保留傳統(tǒng)湯劑中的主要 成分。為有效控制中藥配方顆粒生產(chǎn)各環(huán)節(jié)的質(zhì) 量，國家藥典委員會《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見稿）提出標(biāo)準(zhǔn)湯劑的概念并 將其作為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一 致的標(biāo)準(zhǔn)參照物。按照技術(shù)要求，標(biāo)準(zhǔn)湯劑由不少 于 15 批原料藥材分別制得，用出膏率、有效或指標(biāo) 成分的含量測定及轉(zhuǎn)移率、指紋或特征圖譜等參數(shù) 來表征，以平均值規(guī)定變異可接受范圍確定限度。 釆用 HPLC 或 GC 指紋圖譜技術(shù)，加強(qiáng)其專屬性鑒別 和整體質(zhì)量控制。本研究按照上述要求建立基于標(biāo) 準(zhǔn)湯劑的牛膝配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。